Dag 3 & 4

1. Nu har du gjort både PCR och Southern. Syftet med bägge metoderna var att ta reda på om LL 37-genen fanns i plasmiden. Jämför resultatet och diskutera för-och nackdelar med metoderna.

Både PCR och Southern Blot är metoder som innebär en amplifikation av målsekvensen (den förväntade LL37 genen) som sedan identifieras med gel-elektrofores. Southern Blot innehåller, utöver detta och till skillnad från PCR, flera ytterligare steg: överförsel av DNA-materialet från agarosgelen till ett nylonmembran som sedan prepareras, märks med prober och tvättas, och slutligen behandlas med en fosfatas-antikropp och dess substrat så att DNA-materialet kan åskådliggöras.

Vid Southern Blot undersökte vi vår klyvda plasmidlösning i två utspädda former: 0,5 mikrogram och 0,005 mikrogram. Den högre koncentrationen kunde detekteras efter PCR och efterföljande elektrofores. Den lägre koncentrationen, 0,005 mikrogram, kunde däremot inte detekteras enbart vid PCR och elektrofores, men var detekterbar efter överförsel till nylonmembran och behandling med fosfat-antikropp. Southern Blot-metoden är alltså känsligare än enbart PCR och elektrofores, då den möjliggör detektion av jämförelsevis mindre mängder DNA-material.

PCR-elektrofores är, i jämförelse med Southern Blot, en mycket snabbare metod som innehåller färre moment. PCR-elektrofores är tydligen också den vanligaste molekylärbiologiska analysmetoden i den kliniska verksamheten idag, och kommer förmodligen även att vara det framöver.

2. Vad tycker du är det viktigaste som du har lärt dig under laborationen? 

Laborationerna gav bra träning i planeringen både inför och under laborationerna. Tidsåtgången vid de olika labbmomenten var viktiga att ha bra koll på så att laborationerna gick effektivt från start till slut.