Rening och verifiering av rekombinant plasmid

Vid denna laboration utgår vi från en bakteriekultur med E. coli-bakterier innehållande plasmiden pBluescript SK (+/-) med genen LL37 som kodar för en antibakteriell peptid. Syftet med laborationen är att utvinna plasmidens DNA-molekyler ur ovanstående bakteriesuspension, dvs rena plasmid DNA:t, och därefter verifiera att utvinningen verkligen innehåller plasmid-DNA:t, dvs att reningen lyckats.

Material: Bakteriesuspension, Buffert P1, Buffert P2, Buffert N3, Roche reningskit, Buffert P3, Elutionsbuffert, Buffert EB, Buffert TE, mikrocentrifug, spektrofotometer.

Reningen av plasmiden genomfördes enligt följande steg 1-7:

1. E. coli-bakterierna resuspenderas först i 250 mikrol. Buffert P1 (innehållande RNase A) så att inga klumpar i lösningen är synliga.

2. 250 mikrol. Buffert P2, innehållande natriumdodecylsulfat och natriumhydroxid tillsätts suspensionen och blandas. Vortex ska ej användas. Vid blandningen lyseras bakteriernas cellväggar och vätebindningarna i både det kromosomala DNA:t och i Plasmid-DNA:t bryts. Lösningen ska bli klar och viskös.

3. 350 mikrol. Buffert N3, innehållade Kaliumacetat tillsätts och lösningen blandas så att båda DNA-typerna neutraliseras, dvs vätebindningarna i dessa molekyler återskapas. Lösningen ska bli grumlig.

4. Lösningen centrifugeras i 10 minuter vid 13000 rpm i en mikrocentrifug så att man får en vit utfällning. I supernatanten finns plasmid-DNA och RNA; i utfällningen finns kromosomalt DNA, proteiner och övrig debris.

5. Supernatanten innehållande DNA och RNA placeras sedan med pipett i ett Roche-reningskit. DNA och RNA kommer först att binda till ett silicamembran och lösningen centrifugeras i 30-60 sekunder. Filtratet avlägsnas.

6. Därefter tillsätts en tvättningsbuffert, Buffert PE, så att RNA:t tvättas bort och lösningen centrifugeras i 30-60 sek. Efter det tillsätts Elutionsbuffert så att DNA:t lossnar och lösningen centrifugeras. Eluatet som återstår innehåller det renade plasmid DNA:t. Filtratet avlägsnas och lösningen centrifugeras i 1 minut till.

7. Kolonnen placeras i ett rent 1.5 ml Eppendorfrör. 50 mikrol. Buffert EB eller vatten tillsätts till kolonnen, får stå i 1 minut och därefter centrifugeras i 1 minut, varvid rent Plasmid-DNA erhålls.

Det erhållna DNA:t koncentrationsbestämdes därefter genom en metod som kan sammanfattas enligt nedan:

Plasmidlösningen späds med TE buffert à Spektrofotometern ställs in à Spektrofotometern blankas à Absorbansen för plasmidlösningen mäts vid 260 samt 280 nm à Kurvan fotograferas à Koncentrationen DNA i lösningen beräknas à Kvoten mellan de två olika

absorbansnivåerna beräknas

Frågor på resultatet: 

1. Vilka föroreningar har du förhoppningsvis tagit bort? 

Eftersom vi efter reningen enbart vill ha kvar plasmid-DNA:t, har vi förhoppningsvis fått bort E. coli-bakteriens kromosomala DNA, RNA, proteiner och övriga cellrester (debris).

2. Vad vet du om resultatet? Fick du ren plasmid? 

Plasmid-DNA:ts renhetsgrad bestäms genom att beräkna kvoten av provets absorbansvärden vid spektrofotometri 260 nm respektive 280 nm. Är denna kvot lägre än 1,8 finns hög misstanke om att provet är kontaminerat, dvs innehåller för mycket av de ämnen vi ville ha bort genom reningen. 

Jag och min medlaborant kunde dessvärre inte avläsa ett resultat vid spektrofotometri 280 nm och kunde därmed inte beräkna en kvot för de två aktuella absorbansnivåerna. Vid 260 nm hade vi en absorbans på 0,067, ett värde som inte avviker avsevärt från övriga laboranters värden. (Värdet på koncentrationen avviker inte heller mycket från de andra värdena i gruppen.) Gruppens värden finns i nedanstående tabell.

3. Är det något du funderar på som du vill att vi tar upp vid genomgång nästa labdag eller vid labuppföljningen? 

Vid spektrofotometrin fick vi fram nedanstående kurva. Vad innebär alla lodräta ”hack” i kurvan? Varierar detta utseende ofta mellan olika reningsresultat? Isåfall har det någon betydelse?