Dag 3 & 4

1. Nu har du gjort både PCR och Southern. Syftet med bägge metoderna var att ta reda på om LL 37-genen fanns i plasmiden. Jämför resultatet och diskutera för-och nackdelar med metoderna.

Både PCR och Southern Blot är metoder som innebär en amplifikation av målsekvensen (den förväntade LL37 genen) som sedan identifieras med gel-elektrofores. Southern Blot innehåller, utöver detta och till skillnad från PCR, flera ytterligare steg: överförsel av DNA-materialet från agarosgelen till ett nylonmembran som sedan prepareras, märks med prober och tvättas, och slutligen behandlas med en fosfatas-antikropp och dess substrat så att DNA-materialet kan åskådliggöras.

Vid Southern Blot undersökte vi vår klyvda plasmidlösning i två utspädda former: 0,5 mikrogram och 0,005 mikrogram. Den högre koncentrationen kunde detekteras efter PCR och efterföljande elektrofores. Den lägre koncentrationen, 0,005 mikrogram, kunde däremot inte detekteras enbart vid PCR och elektrofores, men var detekterbar efter överförsel till nylonmembran och behandling med fosfat-antikropp. Southern Blot-metoden är alltså känsligare än enbart PCR och elektrofores, då den möjliggör detektion av jämförelsevis mindre mängder DNA-material.

PCR-elektrofores är, i jämförelse med Southern Blot, en mycket snabbare metod som innehåller färre moment. PCR-elektrofores är tydligen också den vanligaste molekylärbiologiska analysmetoden i den kliniska verksamheten idag, och kommer förmodligen även att vara det framöver.

2. Vad tycker du är det viktigaste som du har lärt dig under laborationen? 

Laborationerna gav bra träning i planeringen både inför och under laborationerna. Tidsåtgången vid de olika labbmomenten var viktiga att ha bra koll på så att laborationerna gick effektivt från start till slut. 

Dag 2

För att undersöka om genen LL37 finns i vår renade DNA-lösning från Dag 1 använder vi först PCR-tekniken; med hjälp av specifika primers för LL37 samt enzymet Taq DNA-polymeras kan vi kopiera LL37-sekvensen i väldigt stor mängd. Resultatet av denna kopiering, amplifikatet, kan sedan analyseras med en gel-elektrofores, i vilken man kan utläsa och jämföra amplifikatets storlek med kända markörer.

Nedanstående foto visar resultatet av vår gel-elektrofores. 6 olika preparationer har placerats i separata lodräta brunnar. Från vänster: Positiv kontroll innehållande genen LL37, Markör III, Vårt prov, Markör IV, Negativ kontroll, Plasmidlösning. (Brunnarna har åskådliggjorts med UV-belysning.)

Frågor: 

Hur blev resultatet? Om du tycker att resultatet blev bra; vilka kontroller har du som gör att du kan lita på resultatet?Om resultatet blev misslyckat; vad tror du är den troligaste orsaken till att det misslyckades? Är det något du funderar på som du vill att vi tar upp vid genomgången nästa labdag eller vid labuppföljningen?

I den tredje brunnen från vänster i ovanstående foto ser vi att Vårt prov har gett upphov till en nukleinsyrasekvens som är av samma storlek som den sekvens som den Positiva kontrollen innehållande en känd LL37-gen också gav upphov till. Slutsatsen blir då att sekvensen som vi ser från Vårt prov också är genen LL37.

Även i brunn 5 från vänster ser vi emellertid att en sekvens som förefaller vara lika stor som LL37-genen har framträtt. Eftersom detta var vår Negativa kontroll är det mycket troligt att det här har skett en kontamination, m a o  har genen LL37 hamnat i vårt rör med den Negativa kontrollen och därefter kopierats och blivit synlig i elektroforesen. Vi kan därför inte veta om Vårt prov verkligen innehåller LL37-genen eller om genen tillförts provet via kontamination. 

Rening och verifiering av rekombinant plasmid

Vid denna laboration utgår vi från en bakteriekultur med E. coli-bakterier innehållande plasmiden pBluescript SK (+/-) med genen LL37 som kodar för en antibakteriell peptid. Syftet med laborationen är att utvinna plasmidens DNA-molekyler ur ovanstående bakteriesuspension, dvs rena plasmid DNA:t, och därefter verifiera att utvinningen verkligen innehåller plasmid-DNA:t, dvs att reningen lyckats.

Material: Bakteriesuspension, Buffert P1, Buffert P2, Buffert N3, Roche reningskit, Buffert P3, Elutionsbuffert, Buffert EB, Buffert TE, mikrocentrifug, spektrofotometer.

Reningen av plasmiden genomfördes enligt följande steg 1-7:

1. E. coli-bakterierna resuspenderas först i 250 mikrol. Buffert P1 (innehållande RNase A) så att inga klumpar i lösningen är synliga.

2. 250 mikrol. Buffert P2, innehållande natriumdodecylsulfat och natriumhydroxid tillsätts suspensionen och blandas. Vortex ska ej användas. Vid blandningen lyseras bakteriernas cellväggar och vätebindningarna i både det kromosomala DNA:t och i Plasmid-DNA:t bryts. Lösningen ska bli klar och viskös.

3. 350 mikrol. Buffert N3, innehållade Kaliumacetat tillsätts och lösningen blandas så att båda DNA-typerna neutraliseras, dvs vätebindningarna i dessa molekyler återskapas. Lösningen ska bli grumlig.

4. Lösningen centrifugeras i 10 minuter vid 13000 rpm i en mikrocentrifug så att man får en vit utfällning. I supernatanten finns plasmid-DNA och RNA; i utfällningen finns kromosomalt DNA, proteiner och övrig debris.

5. Supernatanten innehållande DNA och RNA placeras sedan med pipett i ett Roche-reningskit. DNA och RNA kommer först att binda till ett silicamembran och lösningen centrifugeras i 30-60 sekunder. Filtratet avlägsnas.

6. Därefter tillsätts en tvättningsbuffert, Buffert PE, så att RNA:t tvättas bort och lösningen centrifugeras i 30-60 sek. Efter det tillsätts Elutionsbuffert så att DNA:t lossnar och lösningen centrifugeras. Eluatet som återstår innehåller det renade plasmid DNA:t. Filtratet avlägsnas och lösningen centrifugeras i 1 minut till.

7. Kolonnen placeras i ett rent 1.5 ml Eppendorfrör. 50 mikrol. Buffert EB eller vatten tillsätts till kolonnen, får stå i 1 minut och därefter centrifugeras i 1 minut, varvid rent Plasmid-DNA erhålls.

Det erhållna DNA:t koncentrationsbestämdes därefter genom en metod som kan sammanfattas enligt nedan:

Plasmidlösningen späds med TE buffert à Spektrofotometern ställs in à Spektrofotometern blankas à Absorbansen för plasmidlösningen mäts vid 260 samt 280 nm à Kurvan fotograferas à Koncentrationen DNA i lösningen beräknas à Kvoten mellan de två olika

absorbansnivåerna beräknas

Frågor på resultatet: 

1. Vilka föroreningar har du förhoppningsvis tagit bort? 

Eftersom vi efter reningen enbart vill ha kvar plasmid-DNA:t, har vi förhoppningsvis fått bort E. coli-bakteriens kromosomala DNA, RNA, proteiner och övriga cellrester (debris).

2. Vad vet du om resultatet? Fick du ren plasmid? 

Plasmid-DNA:ts renhetsgrad bestäms genom att beräkna kvoten av provets absorbansvärden vid spektrofotometri 260 nm respektive 280 nm. Är denna kvot lägre än 1,8 finns hög misstanke om att provet är kontaminerat, dvs innehåller för mycket av de ämnen vi ville ha bort genom reningen. 

Jag och min medlaborant kunde dessvärre inte avläsa ett resultat vid spektrofotometri 280 nm och kunde därmed inte beräkna en kvot för de två aktuella absorbansnivåerna. Vid 260 nm hade vi en absorbans på 0,067, ett värde som inte avviker avsevärt från övriga laboranters värden. (Värdet på koncentrationen avviker inte heller mycket från de andra värdena i gruppen.) Gruppens värden finns i nedanstående tabell.

3. Är det något du funderar på som du vill att vi tar upp vid genomgång nästa labdag eller vid labuppföljningen? 

Vid spektrofotometrin fick vi fram nedanstående kurva. Vad innebär alla lodräta ”hack” i kurvan? Varierar detta utseende ofta mellan olika reningsresultat? Isåfall har det någon betydelse?